이봐! 나는 TET -213 세포의 공급 업체이며 오늘은 이들 세포에서 면역 형광 염색을 수행하는 방법을 안내해 줄 것입니다. 면역 형광 염색은 세포 생물학의 세계에서 매우 유용한 기술입니다. 그것은 우리가 세포 내에서 특정 단백질을 시각화하여 그들의 기능과 위치를 더 잘 이해할 수 있도록 도와줍니다.
TET -213 세포 준비
먼저, 우리는 TET -213 셀을 준비해야합니다. 적절한 문화 매체에서 자라서 시작하십시오. 이들 세포는 일반적으로 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 RPMI 1640과 같은 배지에서 잘 수행된다. 5% CO₂ 대기에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
세포가 약 70-80% 합류점에 도달하면 이제 염색 과정을 시작해야합니다. 24- 웰 플레이트의 CoverSlips에 세포를 시드해야합니다. 이것은 염색 단계에서 세포를 더 쉽게 처리 할 수있게한다. 피펫을 사용하여 셀 서스펜션을 커버 슬립에 조심스럽게 옮깁니다. 세포를 골고루 분배하십시오.
세포를 고정합니다
셀이 CoverSlips (보통 24 시간 후)에 부착 된 후에는 수정해야 할 때입니다. 고정은 세포 구조를 보존하고 단백질을 제자리에 유지하기 때문에 중요합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 4% 파라 포름 알데히드 (PFA)와 같은 고정 장치를 사용할 수 있습니다. 커버 슬립의 셀을 덮을 수있는 충분한 PFA를 추가하고 약 15-20 분 동안 실온에서 앉게하십시오.
고정이 완료되면 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오. 각 세척은 약 5 분 동안 지속되어야합니다. 이것은 세포에서 과도한 고정 장치를 제거하는 데 도움이됩니다.
투과
다음은 투과입니다. 이 단계는 항체가 세포에 들어가서 표적 단백질에 결합하도록 허용한다. PBS에서 0.1% Triton X -100과 같은 투과제를 사용하십시오. 투과 용액을 세포에 첨가하고 실온에서 약 10 분 동안 배양하도록합니다.
그 후, 이전 단계에서와 같이 세포를 PBS로 다시 세 번 씻으십시오. 이를 통해 투과제가 완전히 제거되도록합니다.
블로킹
차단은 항체의 비 특정 결합을 방지하는 중요한 단계입니다. PBS에서 5% 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 차단 솔루션을 사용할 수 있습니다. 차단 용액을 세포에 추가하고 실온에서 약 1 시간 동안 배양하도록하십시오.
1 차 항체 배양
이제 1 차 항체를 추가 할 차례입니다. 1 차 항체는 TET -213 세포에서 검출하려는 단백질에 특이 적이다. 제조업체의 지시에 따라 차단 용액에서 1 차 항체를 희석하십시오.
세포에서 차단 용액을 조심스럽게 제거하고 희석 된 1 차 항체를 첨가하십시오. 항체 용액으로 세포를 완전히 덮으십시오. 4 ℃에서 밤새 1 차 항체와 세포를 배양한다. 이 긴 인큐베이션 시간은 항체가 표적 단백질에 효과적으로 결합 할 수있게한다.
다음날, PBS로 세포를 세 번 씻고, 각 세척은 약 5 분 동안 지속됩니다. 이것은 결합되지 않은 1 차 항체를 제거합니다.
이차 항체 인큐베이션
일차 항체 인큐베이션 후, 이차 항체를위한 시간입니다. 2 차 항체는 형광 염료로 표지되어있어 형광 현미경으로 표적 단백질을 시각화 할 수 있습니다.
제조업체의 지시에 따라 차단 용액에서 2 차 항체를 희석하십시오. 세포에서 PBS를 제거하고 희석 된 2 차 항체를 첨가하십시오. 어둠 속에서 약 1-2 시간 동안 실온에서 세포를 배양하십시오. 어두운 환경은 형광 염료가 페이딩되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
인큐베이션이 끝나면 이전과 마찬가지로 PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
카운터 염색
카운터 염색은 세포 핵을 시각화하는 데 사용됩니다. dapi와 같은 염료 (4 ', 6 -Diamidino -2 -Phenylindole)를 사용할 수 있습니다. PBS에서 DAPI를 희석하여 세포에 첨가하십시오. 실온에서 약 5 분 동안 배양하도록하십시오.
그 후, PBS로 세포를 한 번 더 씻어 과도한 DAPI를 제거하십시오.
설치
마지막으로, 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 장착 할 때입니다. 장착 매체를 사용하여 세포를 제자리에 유지하고 형광을 보존합니다. 현미경 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 조심스럽게 놓은 다음 덮개 슬립을 드롭에 뒤집습니다. 커버 슬립과 슬라이드 사이에 기포가 갇히지 않도록하십시오.
이미징
이제 형광 현미경으로 세포를 이미지화 할 준비가되었습니다. 적절한 필터를 사용하여 2 차 항체 및 DAPI에서 형광 신호를 시각화하십시오. 다른 시야에서 여러 이미지를 찍어 세포를 잘 표현할 수 있습니다.
과정에서 관련 펩티드를 사용합니다
세포 배양 및 염색 과정에서 펩티드가 유용하다는 것을 알 수 있습니다. 예를 들어,(Gly14) -Humanin (인간)세포 생존력 및 기능에 유익한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 배양 배지에 추가하여 TET -213 세포에서 연구하는 단백질 발현에 영향을 미치는지 확인할 수 있습니다.
피브로넥틴 CS1 펩티드세포를 시드하기 전에 커버 슬립을 코팅하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 셀 부착 및 확산을 향상시켜 염색 과정을보다 효율적으로 만들 수 있습니다.
엔도 텔린 -1 (11-21)또한 TET -213 세포 내 신호 경로에서 역할을 할 수 있습니다. 배양 배지에 추가 한 다음 면역 형광 염색을 통해 표적 단백질 발현에 어떤 영향을 미치는지 연구 할 수 있습니다.
결론
TET -213 세포에서 면역 형광 염색을 수행하는 것은 약간 까다로운 과정이 될 수 있지만,이 단계를주의 깊게 따라 다니면 훌륭한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 이 세포의 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 줄 수있는 강력한 기술입니다.
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참조
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). 세포의 분자 생물학. 갈랜드 과학.
- Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004). 세포 생물학. 손더스.